Serumersatz durch hPL

Seit längerem ist bekannt, dass humanes Plättchenlysat (= humanes Thrombozytenlysat; engl. human Platelet Lysate; hPL) eine echte Alternative zu dem in der Zellkultur exzessiv genutzten, aber mindestens ebenso umstrittenen, fötalen Kälberserum (FBS) darstellt. Tatsächlich weiß man mittlerweile, dass die Faktoren, die FBS zu einem so hervorragenden Medienzusatz und Serumersatz machen aus aktivierten Rinderthrombozyten stammen und beim Herstellungsprozess in das Serum gelangen. Der Ansatz, direkt auf den Thrombozyten-Inhalt zuzugreifen ist also naheliegend.

Humanes Plättchenlysat erhält man, wenn man die Zellstruktur humaner Thrombozyten aufbricht (die Zellen „lysiert“) und dann alles, was im Zellinneren gelöst ist, durch Zentrifugation von den festen Zellbestandteilen separiert. Beim Plättchenlysat handelt es sich also um ein buntes Molekülgemisch aus dem Thrombozyten-Inneren.
In den letzten Jahren wurden Plättchenlysate schon erfolgreich für verschiedene humane und tierische Zellen und Zelllinien eingesetzt – und konnten vergleichbare bzw. verbesserte Wachstumsergebnisse erzielen.

Wir sind überzeugt davon, dass die Verwendung von FBS in den nächsten Jahren immer stärker hinterfragt werden wird und sich neben definierten, synthetischen Medienrezepturen auch xeno-freie Serum-Alternativen wie das hPL langfristig durchsetzen werden!

Der Wunsch, Nachhaltigkeit und Tierwohl in allen Bereichen unseres Lebens zu fordern und zu fördern, sollte gerade in der naturwissenschaftlichen und medizinischen Forschung nicht verloren gehen. Die Zeit ist reif für einen Wandel in der Kultivierung humaner Zellen; weg von tierischen und unter fragwürdigen Bedingungen gewonnenen Bestandteilen und hin zu xeno-freien Alternativen.

Als Ausgangsstoff für hPL dienen abgelaufene humane Thrombozytenkonzentrate, die von Blutspendediensten hergestellt werden und für Thrombozyten-Spenden vorgesehen sind. Für Transfusionszwecke dürfen die Thrombozytenkonzentrate nur wenige Tage alt sein. Ist ein Zeitraum von 5 Tagen überschritten, müssen sie entsorgt werden. Schätzungen zufolge kommen 5-20 % der Thrombozytenkonzentrate nicht zum Einsatz. Diese Thrombozytenkonzentrate können für die Herstellung von hPL verwendet und so als Serumersatz in der Zellkultur einer neuen Bestimmung zugeführt werden.

Dafür werden die abgelaufenen Thrombozytenkonzentrate zu größeren Volumina „gepooled“, durch Gefrier- und Auftau-Prozesse lysiert und die Zelltrümmer sowie festen Aggregate durch Zentrifugation entfernt.

Humanes Plättchenlysat ist ein komplexes Gemisch aus Proteinen, niedermolekularen Stoffen, Vitaminen, Mineralien und Elektrolyten. Neben dem Thrombozyteninhalt sind auch Bestandteile des Blutplasmas (Plasmaproteine, verschiedene Proteaseinhibitoren und Carrier sowie Fibrinogen) enthalten, da die Thrombozyten gängigerweise in Plasma gelagert werden.

Worauf es aber beim Serumersatz mit hPL besonders ankommt: Thrombozyten beherbergen eine Vielzahl potenter mitogener Wachstumsfaktoren und Cytokine wie EGF, bFGF, IGF-1, HGF, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, TGF-β1, BDNF und VEGF.

Generell kann man sagen, dass hPL für die in-vitro Kultivierung von fast allen humanen und tierischen Zellen geeignet ist.

Thrombozytenlysate werden bereits erfolgreich in der Vermehrung und Erhaltung verschiedenster adhärenter Zellen und Zellen in Suspension eingesetzt. Besonders gut untersucht ist die herausragende Performance in Zusammenhang mit humanen Mesenchymalen Stammzellen (MSCs).  Andere humane Zellen, wie Endothelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten und verschiedene Krebszelllinien wachsen mit hPL ebenfalls sehr gut. Auch für tierische Zellen gibt es mittlerweile viele Beispiele, die die Eignung von hPL als FBS-Ersatz belegen.

Sollte Deine Zelllinie in unserer Aufzählung nicht mit dabei sein, liegt es (auch) an Dir herauszufinden, ob die Zellen mit denen Du arbeitest, für die Kultivierung mit hPL geeignet sind. Und optimalerweise auch gleich, in welcher Konzentration das hPL seine beste Wirkung entfaltet.

Wir bei neoFroxx freuen uns auf Deine Rückmeldung und werden Deine Erfahrungen gerne mit anderen Anwender*innen teilen. Je mehr Feedback wir bekommen, desto besser. Für Dich, für andere Zellkultur-Anwender*innen und vor allem für den gemeinsamen Ausstieg aus dem FBS-Gebrauch.

Falls du Diese Informationen als pdf bevozugst, kannst Du die hPL-Zelllinienübersicht hier downloaden.

Humanes Plättchenlysat ist ebenso wie fötales Kälberserum ein nur vage definierter Medienzusatz. Aber hPL besitzt gegenüber FBS einige entscheidende Vorteile:

• Verursacht kein unnötiges Tierleid
• Sehr hohe Qualität durch hochwertiges und umfassend getestetes Ausgangsmaterial
• Größere Sicherheit; keine Übertragung tierischer Krankheitserreger; Negativtestung auf verschiedenste Viren
• Hohe Chargenstabilität bei ausreichender Poolgröße (>50 Spender) und damit Wegfall der zeitintensiven Chargentestung
• Bessere Reproduzierbarkeit
• Bessere Performance; hPL ermöglicht schnelleres Wachstum bei geringerem Verbrauch: Konzentration im Medium beträgt oft nur 2-5 %
• Xeno-frei; erste Wahl für die in-vitro Kultivierung humaner Zellen
• Herstellung nach GMP möglich; geeignet für klinische Studien und klinische Anwendungen in der Zelltherapie
• Gute Verfügbarkeit und stabiler Preis
• Nachhaltig

Wie beim FBS handelt es sich auch beim hPL streng genommen um ein weiter prozessiertes Abfallprodukt. Allerdings mit dem großen Unterschied, dass es sich bei dem „Rohstoff“ für das hPL um ein hochwertiges medizinisches Produkt handelt, nicht um ein Beiprodukt der Massenschlachtung – und dass für die Gewinnung kein unnötiges Tierleid in Kauf genommen wird. Es sprechen also sowohl qualitative, als auch ethische Gründe für einen Serumersatz durch hPL.

Augen auf beim Lysat-Kauf! Die teilweise unterschiedlichen Ausgangsmaterialien sowie die von Hersteller zu Hersteller variierende Prozessierung der Thrombozyten führen zu deutlichen Unterschieden in der Qualität des finalen Produkts.  hPL ist nicht gleich hPL. Für wichtige Kriterien wie die Poolgröße, Fibrinogen-Gehalt und anschließende Testung auf Zellkultur-relevante Parameter wie Mykoplasmen und Endotoxine gibt es keinen herstellerübergreifenden Qualitätsstandard.

• Fibrinogengehalt. Da humane Thrombozyten-konzentrate in der Regel in Blutplasma gelagert werden, enthält das Plättchenlysat Gerinnungsfaktoren (Fibrinogen). Diese können zwar in einem weiteren Prozessierungsschritt aus dem hPL entfernt werden, häufig werden aber humane Plättchenlysate angeboten, in denen das Fibrinogen enthalten ist. Bei diesen Produkten ist die Zugabe von Antikoagulantien wie Heparin erforderlich, um eine Gelatinierung des Mediums zu verhindern.  Wird dafür das kostengünstige Schweineheparin verwendet ist das fertige Kulturmedium natürlich alles andere als xeno-frei.
  Synthetische Heparine sind verfügbar, aber teuer. Zudem ist bekannt, dass Heparin in höheren Konzentrationen eine negative Wirkung (z. B. reduzierte Proliferation, beeinträchtigte Differenzierung und Zellmigration, geringere Viabilität) auf humane Zellen hat.
  Empfehlenswerter sind daher ganz klar die Fibrinogen-abgereicherten (Fibrinogen-depleted, kurz FD) hPL-Produkte, die ohne Heparin-Zusatz auskommen und „ready-to-use“ sind. Je nach Abreicherungsmethode kann FD-hPL Spuren von Heparin enthalten, die dann aber bei den als „xeno-frei“ deklarierten Produkten synthetischen Ursprungs sein sollten.
• Poolgröße. Wird das hPL aus einem zu geringen Spenderpool (<50) generiert, muss mit Chargenschwankungen gerechnet werden.
• Immunoglobuline. Der Immunoglobulingehalt in hPL ist höher als in FBS.

• Erhältlich in „Fibrinogen-depleted“, ready-to-use ohne Heparin-Zugabe
  
• 100 % Xeno-frei
• Chargenkontinuität durch Pools von 150 bis 300 gesunden Spendern
• Hergestellt in FDA-lizenzierten Blutspendezentren bzw. Blutspendezentren in der EU: Negative Tests auf Hepatitis B, HIV, Hepatitis C, Humane T-lymphotrope Virus 1 und 2, Trypanosoma cruzi, West-Nil-Virus, Syphilis und Zika-Virus
• Hervorragende Performance durch optimierten Herstellungsprozess
• Erhältlich in GMP grade: Hergestellt, geprüft und freigegeben unter Beachtung der GMP-Richtlinien; DMF verfügbar
• Getestet auf Mykoplasmen, Endotoxine, Sterilität und MSC-Performance

Wenn Du Dich für den Serumersatz durch hPL entscheidest, empfehlen wir Dir zu Beginn des Wechsels zunächst verschiedene hPL-Konzentrationen auszuprobieren, um die optimale Konzentration für den jeweiligen Zelltyp und die jeweilige Anforderung zu finden.

Typische Konzentrationen liegen im Bereich von 1-10% und in diesem Fall gilt: Mehr ist nicht gleich besser! Steht die Konzentration einmal fest, sind keine weiteren Testungen (Chargentestungen) mehr nötig.

• Lindl & G. Gstraunthaler, Fetales oder fatales Kälberserum? Das Schmuddelkind der Zellkultur, Laborjournal 7-8/2019
• Rauch et al., Alternatives to the Use of Fetal Bovine Serum: Human Platelet Lysates as a Serum Substitute in Cell Culture Media, ALTEX 28, 4 /2011
• van der Valk et al., Fetal Bovine Serum (FBS): Past – Present – Future, ALTEX 35(1), 2018
• Gstraunthaler & T. Lindl, Auf der Suche nach brauchbaren Serumalternativen, BIOspektrum 06/2017
• Fernandez-Rebollo et al., Human Platelet Lysate versus Fetal Calf Serum: These Supplements Do Not Select for Different Mesenchymal Stromal Cells, Scientific Reports 11/2017
• Bieback et al., Gaps in the knowledge of human platelet lysate as a cell culture supplement for cell therapy: a joint publication from the AABB and the International Society for Cell & Gene Therapy, TRANSFUSION Vol. 59, 2019
• Burnouf et al., Human platelet lysate: Replacing fetal bovine serum as a gold standard for human cell propagation? Biomaterials 76, 2016